凱氏定氮法,是一種經典的測定蛋白質含量的 方法。其國標規定的基本檢測過程包括: 消化: 樣 品和消化劑、硫酸一同加熱,使蛋白質消化分解并 釋放出氨,氨與硫酸結合生成硫酸銨; 蒸餾: 堿化蒸 餾使硫酸銨中的氨游離; 滴定: 用硼酸溶液吸收后 再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定; 計算: 根據酸的消耗量乘以換算系數,即得出樣品中蛋白質含量。整 個過程至少需要 6 h 的時間,其中消化這一過程即 至少需要 3～ 4 h ,耗時較長且操作繁瑣。為此,我 們經過長時間的實踐操作總結,對凱氏定氮法中消 化這一過程進行了改進,以期達到簡化操作,縮短 時間的目的。

1　方法

1. 1　實驗分組 分為 2 組: 對照組和實驗組。兩組在測定樣本 蛋白質含量的過程中,采用不同的消化方法,之后 的蒸餾、滴定、計算方法,則完全相同。

1. 1. 1　對照組: 操作嚴格按照國標規定〔1〕進行。其 采用的消化方法為小火碳化消化法: 取樣品稀釋液 1. 0mL 與消化劑及硫酸一起加入定氮瓶內,于瓶口 放一漏斗,將瓶以 45° 角斜支于有小孔的石棉網上加 熱消化,消化過程要求小火( 400℃) 碳化3 h 左右。

1. 1. 2　實驗組: 采用的消化方法是高溫消化法: 將樣 品稀釋液 1. 0 mL 與消化劑一起加入定氮瓶內保持 1 000℃的高溫持續加熱,其過程要求保持定氮瓶內 液體沸騰,但所產生的蛋白質氣泡不溢出瓶口,同時 產生的蒸餾水氣體在瓶壁遇冷回流,可以將瓶內壁上 的蛋白質帶回瓶底進行消化,整個消化過程大約 1h 。

1. 2　蛋白質含量檢測

1. 2. 1　兩組方法的穩定性、準確性比較: 分別對 50 g/L蛋白校準液(上海申索)及 15 份人血白蛋白 樣品(蛋白含量未知)進行兩種方法的蛋白質含量 檢測,前者重復 15 次。

1. 2. 2　實驗組蛋白回收率檢測(見表 1): 任取 2 種 含蛋白的樣品A 、B(蛋白含量未知) ,每種樣品分別 取3 份各 9. 6 mL,加入 50 g/L 的蛋白標準液 0 μ L、 100 μ L、400 μ L 和分別對應 400 μ L、300 μ L、0 μ L 的生 理鹽水,執行4 次重復試驗,進行2 種方法的蛋白質 含量檢測。最后計算回收率。

1. 3　統計學分析 數據以 x ±SD 表示,兩組間結果比較采用配對 資料的 t 檢驗及回歸分析。

2　結果

2. 1　兩組方法的穩定性、準確性比較(見圖 1) 對50 g/L 蛋白校準液進行蛋白質含量檢測結 果,國標消化法為 49. 95 g/L±0. 00 g/L,高溫消化 法為 49. 91 g/L±0. 00 g/L,兩種方法無顯著差異(t =1. 1602, P >0. 05)。蛋白校準液氮含量檢測結 果: 國標消化法為8. 20 g/L±0. 00 g/L,高溫消化為 8. 21 g/L ±0. 00 g/L,2 種方法無顯著差異( t =
1. 000, P >0. 05)。 對人血白蛋白樣品進行蛋白質含量檢測結果, 國標消化法為 97. 61 g/L±0. 57 g/L,高溫消化法為 97. 65g/L ±0. 55 g/L,兩種方法無顯著差異( t = 0. 5762, P >0. 05)。樣品氮含量結果: 國標消化法為 15. 6 g/L±0. 01 g/L,高溫消化為 15. 6 g/L±0. 01g/L, 兩種方法無顯著差異( t =0. 8069, P >0. 05)。 將兩種方法對蛋白標液和樣品檢測結果進行 回歸分析(見圖 2) ,得出Y =0. 9987 X +0. 0797 , R2 =0. 9999。
2. 2　實驗組蛋白回收率檢測 結果見表 1。相對 標準偏 差分別 為 1. 7%、 0. 8%、1. 7%和 1. 2%,兩種分別加入 0 μ L、100 μ L、 400 μ L、50 g/L 的蛋白標準液的混合樣品回收率分別 為: 98. 0%、97. 5%、98. 0%和98. 5%,平均為 98. 0%3　討論 近年來,對樣品中蛋白質含量檢測的準確度要 求越來越高,特別是奶粉的“三聚氰胺”事件發生以 來,在對有關含氮的各檢測方法中凱氏定氮法的標 準地位也再一次被確定。凱氏定氮法不僅是對含 氮的有機化合物定量的標準方法,也是蛋白質含量 測定最經典的方法,但其同時也存在操作步驟多, 耗費時間長等缺點。國標規定的凱氏定氮法測定 蛋白質含量時,其消化過程要求小火碳化,溫度約 400℃,待 樣品 呈澄 清透 明后 再繼 續大 火 消化 30 min ,總消化過程需要 3～ 4 h ,整個蛋白檢測過程 至少需要 6 h 的時間。

為了縮短檢測時間,本實驗室采用高溫持續消 化的方法代替國標的小火碳化消化法,使加熱溫度 保持在1 000℃左右,使消化液處于持續沸騰狀態, 同時產生的蛋白質泡沫又不溢出瓶口。高溫消化 法使消化過程縮短為 1 h 左右,使整個蛋白檢測過 程縮短為 3～ 4 h。 通過高溫和小火碳化兩種消化方法對樣本蛋白含量進行檢測并比較,結果顯示: 兩種測定方法 在穩定性、準確性方面無顯著差異。兩種方法比較 的回歸分析顯示斜率為 0. 9987,接近于 1. 00,顯示 出的比例分析誤差是 0. 13%,這種誤差相當于在 50 g/L為-0. 065 g/L,在 100 g/L 為-0. 065 g/L。Y 軸截矩接近于 0,表明固有系統誤差很小,符合實驗 要求。回收率測定 x =98. 0%,即相當于 2%的比 例誤差。這一誤差小于實驗允許的總誤差,再次驗 證了該方法具有良好的準確性。 但本實驗室經多次試驗與統計學分析發現,高 溫消化方法并不適用于免疫球蛋白含量較高的樣 品的蛋白含量檢測,其原因有待于進一步探索。

綜上所述,本研究揭示高溫消化方法檢測蛋白 含量結果準確、快速,較國標規定的方法大大縮短 了工作時間,提高了工作的效率,適于廣泛推廣。